基于礦物元素指紋分析中國地理標志豬肉的產地溯源

近年來，特色地理標志農產品受到消費者的青睞。我國高端豬肉的推廣具有地域性。目前市場上推廣了許多地理標志豬肉，比如北京黑六、萊蕪豬、巴彥豬肉等。地域特色豬肉的產地保護，是保障其品質的重要方法，可使企業(yè)與消費者建立信賴關系。產地溯源是產地保護的重要手段?，F(xiàn)在報道的產地溯源技術主要有穩(wěn)定同位素溯源技術[1]，礦物元素指紋分析技術[2]，近紅外光譜技術[3]，核磁技術[4]，有機成分指紋分析[5]，DNA 技術等[6-8]。

礦物元素分析被認為是食品產地溯源最為可靠的技術手段之一[9]。生物體內的礦物元素組成受氣候、環(huán)境、生物代謝類型等因素的影響。在不同地理生態(tài)環(huán)境下，生物體中礦物元素含量存在差異。礦物元素含量與多元統(tǒng)計分析結合，是實現(xiàn)礦物元素評估驗證生物樣品來源的重要手段。常采用的統(tǒng)計分析手段有方差分析、多重比較分析、主成分分析、聚類分析、判別分析等[10-13]。

目前國內該類技術大多應用在植物源性農產品中，比如水果蔬菜、谷物、茶葉等[14-17]。在動物源性食品中的應用主要有羊肉[18,19]，牛肉[20,21]，雞肉[22,23]等。目前礦物元素指紋技術應用到豬肉產地溯源的研究較少。豬的飼養(yǎng)方式存在差異性和復雜性，目前，有研究探索喂養(yǎng)方式與豬肉中礦物元素含量之間的相關性[24,25]。這些研究可以為豬肉的產地溯源提供一定依據。韓國的Kim Kyong Su 在豬肉產地溯源方面研究較多[26-28]。2017 年，Kim Kyong Su 通過豬肉中多種礦物元素含量將韓國豬肉與進口的美國、德國、澳大利亞、荷蘭、比利時的豬肉進行了區(qū)分，判別率達到97%。2018 年，Kim Kyong Su 將礦物元素和碳氮同位素比率聯(lián)用對韓國和非韓國的豬肉進行判別，判別率達到了100%。目前我國對豬肉的產地溯源研究較少。地理標志豬肉為保證其地域屬性，一般不存在異地調種、異地育肥的問題。因此地域信息的干擾少，礦物元素指紋分析可作為其產地溯源的可靠技術手段。

本文主要針對具有特色地域標志的高品質豬肉開展研究。通過對四川巴山的青峪黑豬肉，山東萊蕪黑豬肉和北京黑六豬肉中33種礦物質元素含量進行統(tǒng)計分析，初步探索礦物元素含量在中國地域特色豬肉產地溯源中應用的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試豬肉材料為四川青峪黑豬后腿肉（n=10）（巴中市巴山牧業(yè)股份有限公司），山東萊蕪黑豬后腿肉（n=6）（得利斯集團萊蕪畜牧科技有限公司）和北京黑六黑豬后腿肉（n=10）（北京黑六牧業(yè)科技有限公司）。

濃硝酸（優(yōu)級純）、30%雙氧水（優(yōu)級純），國藥集團化學試劑有限公司；33種元素多元素混標（10 μg/mL），SCP SCIENCE；去離子水（電阻率18.2 MΩ·cm，20 ℃），費爾德Field-X 純水機；In、Ge、Rh、Re 單元素標準溶液（1000 mg/L），Inorganic Ventures。

1.2 儀器與設備

TOPEX+智能型微波消解儀，上海屹堯儀器科技發(fā)展有限公司；ICAP RQ電感耦合等離子體質譜儀（ICP-MS），賽默飛世爾科技。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

取新鮮豬后腿肉瘦肉部分，切成小塊，放入絞肉機絞拌均勻。稱取0.5000 g 左右樣品，置于微波消解管中，加入6 mL 硝酸和2 mL 雙氧水，按照微波消解程序進行消解。消解后得到澄清溶液，趕酸后用超純水定容至15mL，待測，高含量元素經稀釋后測量。飼養(yǎng)用水，取5 mL 加2 mL 硝酸，按照微波消解程序進行消解，趕酸后用超純水定容至15 mL 待測，高含量元素經稀釋后測量。每個樣品稱量2 個平行試樣。微波消解升溫條件如表1 所示。

表1微波消解條件
Table 1 Temperature programming of Microwave Digestion

1.3.2 樣品分析

測定樣品中Na、K、Mg、Ca、B、Ti、Al、Mn、Fe、Co、Cu、Zn、As、Se、Rb、Li、Be、V、Cr、Ni、Mo、Ag、Cd、Sr、Sn、Sb、Ba、La、Ce、Pb、U、Tl、Bi 共33 種元素含量。

用外標法進行定量分析，用10 μg/L Rh、Re、In、Ge 內標元素保證儀器的穩(wěn)定性。ICP-MS 儀器條件如表2 所示。

表2ICP-MS 儀器條件
Table 2 Instrument Conditions of ICP-MS

表333種元素檢出限
Table 3 Detection Limit of 33 elements

表4 不同產地豬肉中無機元素含量
Table 4 Elements concentration of pork from different origins

注：表格中的數(shù)值用平均值±標準偏差表示。

1.4 數(shù)據處理

檢出限的測定：在與分析實際樣品完全相同的條件下，連續(xù)測量試劑空白11 次，計算試劑空白觀測值的標準偏差Sb，3 倍Sb 除以標準曲線斜率b，即為方法檢出濃度。按照稱樣量0.5g，定容體積15 mL 計算得出方法檢出限。應用安捷倫MassProfiler Professional軟件對數(shù)據進行方差分析和主成分分析以及支持向量機、決策樹、樸素貝葉斯、神經網絡的分類分析；用Excel 對數(shù)據進行多重比較分析[29]；用上海易算生物科技有限公司的悟空：快速查看與分析數(shù)據云平臺對數(shù)據進行PLS-DA 和OPLS-DA 判別分析（https://www.omicsolution.org/wkomics/main）。

2 結果與討論

2.1 豬肉中元素含量分析

2.1.1 豬肉中各元素含量

ICP-MS具有靈敏度高，可同時分析多種元素，分析耗時短等優(yōu)點。ICP-MS法目前成為多元素測定領域最先進，最準確的分析方法。肉類樣品中無機元素含量最多的是鉀，其次是鈉，多價金屬鎂、鈣、鋅、鐵的含量也較多，其他的金屬含量較少。含量少的元素，有的低于或接近檢出限，不適用于元素含量的測定和分析。因此本文分析了該測定方法各元素的檢出限，以排除豬肉樣品中含量低于或接近檢出限的元素。各元素檢出限見表3。根據各元素檢出限，篩選出Ca、Ti、Mn、Fe、Co、Cu、Zn、Se、Rb、Sr、K、Na、Mg 共13個元素進行統(tǒng)計分析。以上13種元素含量見表4。數(shù)據顯示，豬肉樣品中，K 含量最高，一般在3000～3500 mg/kg，其次是Na，含量在300～500 mg/kg 之間，然后是鎂，含量在200～250 mg/kg 之間，Ca、Fe、Zn 含量為幾十毫克每千克，Rb 和Sr 含量為幾毫克每千克，其他元素含量較低。每種元素含量的變異系數(shù)均不大，說明豬肉樣品個體間礦物元素含量受干擾因素影響較小，樣本的代表性相對合理。

2.1.2 豬肉樣品中礦物元素的地域差異性分析

對13 種元素含量數(shù)據進行方差分析，結果顯示，樣品中Na、Fe、Co、Cu、Zn、Se、Rb、Sr 共8 種元素在地域之間差異顯著（p＜0.05）。LSD 法多重比較分析結果見表5，其中LSD0.05表示顯著水平為0.05 時的最小顯著差。計算兩組平均數(shù)的差值（?a-?b），如其絕對值大于LSD0.05 即表示在0.05水平上差異顯著；反之，則在0.05 水平上差異不顯著。如果差異顯著，兩組平均數(shù)差值為正，則a 組顯著高于b 組，反之，則a 組顯著低于b 組。LSD0.05代表差異顯著差值，LSD0.01代表差異極顯著差值。結果顯示（見表5），四川青峪豬肉中Se 和Na 含量顯著極高于其他兩地豬肉。這主要是受地理條件的影響。從各養(yǎng)殖基地采集的飼養(yǎng)用水中元素含量結果顯示（結果見表6），四川青峪豬肉飼養(yǎng)用水中Na 含量明顯高于其他兩地。從我國農業(yè)科學研究院發(fā)布的中國土壤硒元素含量分布圖中可以看出，四川達州位于四川東部大巴山腹心地帶，地處川渝鄂陜四省市結合部，土壤富硒。萊蕪黑豬肉中Co含量顯著高于其他兩地豬肉，與飼養(yǎng)用水中Co元素含量結果顯示一致。萊蕪黑豬肉中Rb 和Sr 含量顯著低于其他兩地豬肉，北京黑六豬肉中Zn 和Fe 含量顯著低于其他兩地豬肉，這些結果可能與其他環(huán)境因素息息相關。

表5 LSD 法多重比較分析結果表
Table 5 LSDmethod multiple comparison analysis results

注：表格中LW 代表萊蕪黑豬，HL代表北京黑六黑豬，QY 代表四川青峪黑豬。

表6 不同產地豬飼養(yǎng)用水中無機元素含量
Table 6 Elements concentration in feeding water of pork from different origins

注：表格中的數(shù)值用平均值±標準偏差表示，“/”未檢出。

2.2 豬肉中元素含量的主成分分析

主成分分析通過降維的作用，利用少數(shù)的幾個綜合指標反映眾多指標的信息，從而把樣品中多元素信息更直觀的表現(xiàn)出來。通過主成分分析的結果也可以判斷篩選的特征元素的差異情況。對在2.1中篩選出的，豬肉中具有地域間顯著差異的8 種元素進行主成分分析。結果表明（見圖1），前三個主成分的方差貢獻率分別為53.33%、26.11%、9.00%，累計方差貢獻率達到88.44%，能夠達到充分反映原始數(shù)據信息的目的。從前三個主成分的3D得分圖可以看出，利用第一主成分、第二主成分、第三主成分可以區(qū)分不同地區(qū)的豬肉樣品。從主成分的特征向量（表7）可以看出，其中第一主成分主要綜合了樣品中Na、Fe、Co、Cu、Zn 和Se 六種元素含量的信息。第二主成分主要綜合了樣品中Rb 和Sr 含量的信息。第三主成分主要綜合Na、Co、Cu 和Se 元素含量的信息。

表7 第一、第二和第三主成分的載荷
Table 7 Loading of first three principal components PC1, PC2, PC3

2.3 產地的不同分類模型分析

2.3.1 偏最小二乘法判別分析和基于正交信號校正的偏最小二乘判別分析

偏最小二乘法判別分析是一種用于判別分析的多變量統(tǒng)計分析方法。PLS-DA 和OPLS-DA 對于小樣本量和較少自變量的數(shù)據的分析具有一定的優(yōu)勢。圖2中橘色區(qū)域LW 代表萊蕪黑豬，藍色區(qū)域HL 代表北京黑六，灰色區(qū)域QY 代表青峪黑豬。從圖2 中可以看出，橘色區(qū)域和灰色區(qū)域有重疊部分，且較為分散。采用留一法進行交叉驗證，從交叉檢驗結果（見表8）可以看出，雖然北京黑六和四川青峪黑豬的預測完全正確，但萊蕪黑豬被錯誤預測到其他組中。與PLS-DA 相比較，OPLS-DA 加了正交校正之后數(shù)據檢出假陽性會降低，所以會更準確。圖3 中綠色區(qū)域QY代表青峪黑豬，紅色區(qū)域LW 代表萊蕪黑豬，藍色區(qū)域HL代表北京黑六。從OPLS-DA 得分圖中能明顯看出三地豬肉樣品被完全區(qū)分開。其中R2X 和R2Y 表示模型與實驗觀測值的相關性，即表示擬合程度的好壞，R2越接近1 模型對樣本的擬合能力越強，相關性越大。Q2Y 則為通過交叉驗證計算得出，用以評價模型的預測能力，數(shù)值越接近1 說明模型預測能力越好，通常情況下，R2、Q2Y 高于0.5較好，且兩者差值越小代表預測結果與實際結果越接近。RMSEE 表示模型的計算值與樣本真實值的偏離度。RMSEE 越小越好[31]。評價模型優(yōu)劣的統(tǒng)計量分比為R2X=0.854，R2Y=0.809，Q2Y=0.771，RMSEE=0.208。OPLS-DA判別方法可以得到100%的交叉驗證準確率。綜合看來模型并未過擬合，且有較好的預測能力。

圖1第一、第二和第三主成分標準化3D 得分散點圖
Fig.13DScore Scatter plot of first three principal components
PC1, PC2 and PC3

圖2第一、第二主成分PLS-DA 得分圖
Fig.2Score Scatter plot of first two principal components PC1 and PC2

圖3第一、第二主成分OPLS-DA 得分圖
Fig.3Score Scatter plot of first two principal components PC1 and PC2

表8PLS-DA 對不同產地豬肉判別結果表
Table 8 PLS-DA discriminant result table for pork from different producing areas

表9不同分類模型的交叉驗證結果
Table 9 Accuracy of the prediction algorithm by cross-validation

表10 不同分類模型的外部測試集驗證結果
Table 10 Accuracy of the prediction algorithm by External validation set

2.3.2 其他分類模型我們還應用支持向量機（Support Vector Machine）、決策樹(Decision Tree)、樸素貝葉斯（Naive Bayes）和神經網絡（Neural Network）四種分類方法，建立預測模型，考察其預測的準確率。采用留一法進行交叉驗證，測試算法準確性。其中支持向量機的交叉驗證結果的準確率為100%，決策樹的交叉驗證準確率為88.46%，樸素貝葉斯的交叉驗證準確率為92.31%，神經網絡的交叉驗證準確率最低。此外，林昕等[30]在研究化學計量學工具在基于礦物元素指紋分析的茶葉產地溯源中應用的結果也顯示，神經網絡的驗證準確率一般相較于決策樹要低。通過外部驗證數(shù)據驗證模型的準確性。驗證結果顯示（見表10），決策樹分類模 型能夠將三個類別的樣品全部準確歸類。四種分類模型中，決策樹分類模型結果最優(yōu)，這也與林昕等[30]的研究結果一致。

3 結論

3.1通過對三種不同地域來源的地理標志豬肉中礦物元素含量的測定，結合統(tǒng)計學分析，篩選出有效地域判別元素指標，初步確定了礦物元素指紋分析對我國豬肉產地溯源的可行性。根據肉類樣品中某些礦物元素含量極低的特點，通過檢出限的測定，篩除了一些含量極低的不適合做統(tǒng)計分析的元素指標。通過方差分析，篩選出Na、Fe、Co、Cu、Zn、Se、Rb、Sr共8 種元素在三地豬肉之間差異顯著。通過多重比較分析，將各元素間差異與地理環(huán)境因素相互對應。為了進一步了解和驗證利用礦物元素含量對特色地域豬肉進行產地溯源的可行性，用8 個具有地域顯著差異的元素構建分類模型。判別分析是一種根據觀察或測量到的若干變量值，來判斷研究對象如何分類的常用統(tǒng)計分析方法。我們選擇了PLS-DA，OPLS-DA，支持向量機、決策樹、樸素貝葉斯和神經網絡六種分類方法。對比發(fā)現(xiàn)，OPLS-DA 和支持向量機交叉驗證準確率達到100%，較適合應用于利用礦物元素指紋分析的特色豬肉產地溯源。通過結合礦物元素含量分析和化學計量學分析手段，可實現(xiàn)三個不同地域來源的地理標志豬肉的產地溯源。

3.2 本研究通過對小樣本和地理區(qū)分明顯豬肉樣本進行初步探索研究，得到礦物元素指紋分析可較好的進行地域判別的效果。礦物元素指紋分析是一種有效的溯源技術，能夠反映環(huán)境地理因素差異，該技術對我國豬肉進行產地溯源研究可靠性高，在我國豬肉的產地溯源和特色地理標志性豬肉保護中具有廣泛應用前景。